TY - JOUR

T1 - Апробация различных вариантов RNA-seq для идентификации аутронов генов у плоского червя Opisthorchis felineus

AU - Ershov, N. I.

AU - Maslov, D. E.

AU - Bondar, N. P.

N1 - Апробация различных вариантов RNA-seq для идентификации аутронов генов у плоского червя Opisthorchis felineus // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2020. - Т. 24. - № 8. - С. 897-904

PY - 2020

Y1 - 2020

N2 - Opisthorchis felineus - представитель паразитических плоских червей, один из возбудителей описторхоза человека. Недавно нами была проведена сборка генома O. felineus, однако корректная аннотация генов в этом геноме стандартными методами оказалась затруднена наличием сплайс-лидер зависимого транс-сплайсинга (SLTS). В результате SLTS исходный 5’-конец (аутрон) транскриптов заменяется короткой сплайс-лидерной последовательностью, донором которой выступает специализированная молекула SL РНК. SLTS вовлечен в процессинг РНК более половины всех генов O. felineus, из-за чего становится невозможным установить последовательности аутронов и реальные старты транскрипции соответствующих генов и оперонов, опираясь только на данные mRNA-seq. В настоящей работе мы провели апробацию различных экспериментальных подходов для идентификации последовательностей аутронов у O. felineus с помощью массового параллельного секвенирования. Два подхода были спланированы нами для прицельного секвенирования процессированных разветвленных аутронов. Первый заключался в сиквенс-специфичной обратной транскрипции с SL-интрона в направлении 5’-конца аутрона. Во втором использовалась гибридизация аутронов с иммобилизованным одноцепочечным ДНК-зондом, комплементарным SL-интрону. Также были использованы два подхода к секвенированию тотальной РНК, обедненной по рРНК, позволяющих идентифицировать более широкий спектр транскриптов, чем mRNA-seq. Один из них основан на ферментативной элиминации перепредставленных кДНК, другой - на ферментативной деградации некэпированных РНК экзонуклеазой Terminator. С помощью селективных методов нам не удалось получить обогащения препаратов РНК по процессированным аутронам, что, наиболее вероятно, связано с коротким временем жизни этих промежуточных продуктов транс-сплайсинга. Из двух методов обеднения по рРНК высокую эффективность показал метод, основанный на ферментативной нормализации кДНК (Zymo-Seq RiboFree). Он позволил примерно вдвое увеличить долю прочтений, соответствующих аутронам и интронам, по сравнению с mRNA-seq. Полученные результаты предполагают, что основным ресурсом последовательностей аутронов в пуле РНК O. felineus служат новосинтезированные непроцессированные транскрипты.

AB - Opisthorchis felineus - представитель паразитических плоских червей, один из возбудителей описторхоза человека. Недавно нами была проведена сборка генома O. felineus, однако корректная аннотация генов в этом геноме стандартными методами оказалась затруднена наличием сплайс-лидер зависимого транс-сплайсинга (SLTS). В результате SLTS исходный 5’-конец (аутрон) транскриптов заменяется короткой сплайс-лидерной последовательностью, донором которой выступает специализированная молекула SL РНК. SLTS вовлечен в процессинг РНК более половины всех генов O. felineus, из-за чего становится невозможным установить последовательности аутронов и реальные старты транскрипции соответствующих генов и оперонов, опираясь только на данные mRNA-seq. В настоящей работе мы провели апробацию различных экспериментальных подходов для идентификации последовательностей аутронов у O. felineus с помощью массового параллельного секвенирования. Два подхода были спланированы нами для прицельного секвенирования процессированных разветвленных аутронов. Первый заключался в сиквенс-специфичной обратной транскрипции с SL-интрона в направлении 5’-конца аутрона. Во втором использовалась гибридизация аутронов с иммобилизованным одноцепочечным ДНК-зондом, комплементарным SL-интрону. Также были использованы два подхода к секвенированию тотальной РНК, обедненной по рРНК, позволяющих идентифицировать более широкий спектр транскриптов, чем mRNA-seq. Один из них основан на ферментативной элиминации перепредставленных кДНК, другой - на ферментативной деградации некэпированных РНК экзонуклеазой Terminator. С помощью селективных методов нам не удалось получить обогащения препаратов РНК по процессированным аутронам, что, наиболее вероятно, связано с коротким временем жизни этих промежуточных продуктов транс-сплайсинга. Из двух методов обеднения по рРНК высокую эффективность показал метод, основанный на ферментативной нормализации кДНК (Zymo-Seq RiboFree). Он позволил примерно вдвое увеличить долю прочтений, соответствующих аутронам и интронам, по сравнению с mRNA-seq. Полученные результаты предполагают, что основным ресурсом последовательностей аутронов в пуле РНК O. felineus служат новосинтезированные непроцессированные транскрипты.

KW - Opisthorchiasis

KW - Outron

KW - Ribosomal RNA

KW - Spliced leader trans-splicing

KW - Start of transcription

KW - Transcriptome

UR - http://www.scopus.com/inward/record.url?scp=85100564312&partnerID=8YFLogxK

UR - https://elibrary.ru/item.asp?id=44446749

U2 - 10.18699/VJ20.688

DO - 10.18699/VJ20.688

M3 - статья

C2 - 35088003

AN - SCOPUS:85100564312

VL - 24

SP - 897

EP - 904

JO - Вавиловский журнал генетики и селекции

JF - Вавиловский журнал генетики и селекции

SN - 2500-0462

IS - 8

M1 - 11

ER -