TY - JOUR

T1 - ИММУНОГЕННОСТЬ И ИНВАЗИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА Bacillus ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ

AU - Donchenko, N. A.

AU - Kozlova, Yu N.

AU - Koptev, V. Yu

AU - Yan, F.

AU - Khomenko, Yu S.

AU - Nefedova, E. V.

AU - Afonyushkin, V. N.

AU - Mishukova, O. V.

AU - Ermakova, L. P.

AU - An, K. V.

AU - Novik, Ya V.

N1 - Carried out within the framework of the state assignments of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (NSAU No. 123121500008-1 and ICBFM SB RAS No. 121031300043-8)

PY - 2024

Y1 - 2024

N2 - Иммуномодулирующие эффекты пробиотиков на основе микроорганизмов рода Bacillus связаны с их способностью к проникновению через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта в кровеносную систему. Представляется перспективным создание рекомбинантных вакцин на основе микроорганизмов рода Bacillus, продуцирующих рекомбинантные антигены наиболее значимых и антигенно изменчивых вирусных и бактериальных агентов сельскохозяйственной птицы, свиней и крупного рогатого скота. Проблема пероральной вакцинации заключается в развитии пищевой иммунотолерантности, связанной с вовлечением в реакции адаптивного иммунитета CD4+ и CD8+/Treg лимфоцитов, подавляющих иммунный ответ в отношении вводимого антигена. В настоящей работе впервые показано, что наличие инвазивности у микроорганизмов родов Bacillus и Geobacillus служит важным, но не единственным фактором, определяющим их иммуногенность. Мы установили, что, помимо B. subtillis, в качестве средства доставки рекомбинантных антигенов можно рассматривать B. atrophaeus. Нашей целью был поиск штаммов рода Bacillus,обладающих оптимальной инвазивностью и иммуногенностью, как пероральных средств доставки рекомбинантных антигенов с эффектом преодоления пищевой иммунотолерантности. Культуры микроорганизмов рода Bacillus были предоставлены Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН) (22 культуры) и ООО «СибАФ» (г. Бердск) (7 культур). Идентификацию культур проводили методом секвенирования 16S рибосомальной РНК по Сэнгеру. Штаммы высевали на 3 % триптиказо-соевой бульон (TSB), 0,5 % дрожжевой экстракт (YE) и 1,5 % агар Bacto («BD Biosciences», США), после чего инкубировали при 37 °C в течение 16 ч. Бактериальные клетки инактивировали прогреванием при 65 °С в течение 3 ч и добавлением фурацилина до концентрации 0,1 %. Культуры 29 штаммов тестировали на иммуногенность in vivoна мышах-гибридахF1 (A/Sn × Balb/C). Животным выпаивали перорально через зонд по 200 мкл культуральной жидкости микроорганизмов родовBacillusиGeobacillusв концентрации 0,7 ед. McF, 3-кратно с интервалом 7 сут. Через 3 нед брали кровь для серологических исследований. Показатели иммуногенности и инвазивности оценивали в реакции агглютинации с флуоресцентно меченными О-антигенами. Реакцию агглютинации проводили с сыворотками крови мышей. Инвазивность при пероральном введении культур рода Bacillus оценивали посредством постановки биопробы на 10-суточных цыплятах (Gallus gallus L.) кросса Shaver. Ежесуточно в течение 10 сут цыплятам вводили 1-суточную культуру исследуемого микроорганизма в дозе 200 мкл орально (1 млрд КОЕ/мл). На 11-е сут проводили убой и делали посевы биоматериала (мышцы, печень и сердце) на мясопептонный агар и в мясопептонный бульон. Также анализировали инвазивность микроорганизмов рода Bacillus на мышах линии С57Black. Животным вводили орально по 100 мкл культуры микроорганизма 1 раз в сутки в течение 2 сут подряд. На 3-и сут проводили убой и делали посевы материала печени и сердца на Eugonic агар, мясопептонный агар и в мясопептонный бульон. При проведении теста на наличие биосурфактантной активности Oil spreading assay культуральную жидкость разводили дистиллированной водой и вносили 20 мкл нефти. В качестве негативного контроля использовали дистиллированную воду, в качестве позитивного контроля — SDS (sodium dodecyl sulfate, 1 % v/v). Разрушение нефтяного пятна учитывали как положительный результат. Только 27,5 % культур микроорганизмов рода Bacillus инициировали образование антител к собственным корпускулярным антигенам при пероральном введении мышам F1 (A/Sn × Balb/C). Среди изученных культур B. subtilis образование антител вызывали 71,42 %. Образование антител также стимулировали культуры других видов: B. atrophaeus B8, изолят B23 B. zhangzhoulensis (по другим источникам отнесен к B. pumilus или B. safensis),штамм B. licheniformis В10. Большинство микроорганизмов рода Bacillus не стимулировали продукцию антител к собственным антигенам. Культуры B. mucoides/B. weihenstephanensis B31, B. simplex B32, B. thuringiensis B20, B. subtillis, B. amyloliquefaciens 2-15, Bacillus spp.1’-37-7 оказывали патогенное действие, сопровождавшееся гибелью мышей при пероральном введении: погибало от 25 до 50 % особей. При пероральном введении культур рода Bacillus птице у всех опытных кур грудные и бедренные мышцы были контаминированы на 100 %, печень и сердце — соответственно на 96 и 52 %. Инвазивность для мышей характеризовалась выявлением микроорганизмов в образцах печени и сердца через 18 ч после последнего перорального введения. Устойчивой инвазивностью обладали культуры Bacillusspp. B56, Bacillusspp. В50, B. atrophaeus B8 и B. safensis В23. Однако антитела были обнаружены только к B. atropheus B8 и B. safensis В23. Биосурфактантной активностью обладали культуры B23 и В24 B. zhangzhoulensis/B. safensis/B. pumilus, B. atrophaeus B8. Статистически значимой ассоциации между наличием биосурфактантной активности и инвазивностью на анализируемой выборке мы не обнаружили. Таким образом, потенциал пробиотических штаммов на основе микроорганизмов Bacillus subtilis в качестве носителей рекомбинантных вакцинных антигенов представляется нам наиболее перспективным.

AB - Иммуномодулирующие эффекты пробиотиков на основе микроорганизмов рода Bacillus связаны с их способностью к проникновению через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта в кровеносную систему. Представляется перспективным создание рекомбинантных вакцин на основе микроорганизмов рода Bacillus, продуцирующих рекомбинантные антигены наиболее значимых и антигенно изменчивых вирусных и бактериальных агентов сельскохозяйственной птицы, свиней и крупного рогатого скота. Проблема пероральной вакцинации заключается в развитии пищевой иммунотолерантности, связанной с вовлечением в реакции адаптивного иммунитета CD4+ и CD8+/Treg лимфоцитов, подавляющих иммунный ответ в отношении вводимого антигена. В настоящей работе впервые показано, что наличие инвазивности у микроорганизмов родов Bacillus и Geobacillus служит важным, но не единственным фактором, определяющим их иммуногенность. Мы установили, что, помимо B. subtillis, в качестве средства доставки рекомбинантных антигенов можно рассматривать B. atrophaeus. Нашей целью был поиск штаммов рода Bacillus,обладающих оптимальной инвазивностью и иммуногенностью, как пероральных средств доставки рекомбинантных антигенов с эффектом преодоления пищевой иммунотолерантности. Культуры микроорганизмов рода Bacillus были предоставлены Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН) (22 культуры) и ООО «СибАФ» (г. Бердск) (7 культур). Идентификацию культур проводили методом секвенирования 16S рибосомальной РНК по Сэнгеру. Штаммы высевали на 3 % триптиказо-соевой бульон (TSB), 0,5 % дрожжевой экстракт (YE) и 1,5 % агар Bacto («BD Biosciences», США), после чего инкубировали при 37 °C в течение 16 ч. Бактериальные клетки инактивировали прогреванием при 65 °С в течение 3 ч и добавлением фурацилина до концентрации 0,1 %. Культуры 29 штаммов тестировали на иммуногенность in vivoна мышах-гибридахF1 (A/Sn × Balb/C). Животным выпаивали перорально через зонд по 200 мкл культуральной жидкости микроорганизмов родовBacillusиGeobacillusв концентрации 0,7 ед. McF, 3-кратно с интервалом 7 сут. Через 3 нед брали кровь для серологических исследований. Показатели иммуногенности и инвазивности оценивали в реакции агглютинации с флуоресцентно меченными О-антигенами. Реакцию агглютинации проводили с сыворотками крови мышей. Инвазивность при пероральном введении культур рода Bacillus оценивали посредством постановки биопробы на 10-суточных цыплятах (Gallus gallus L.) кросса Shaver. Ежесуточно в течение 10 сут цыплятам вводили 1-суточную культуру исследуемого микроорганизма в дозе 200 мкл орально (1 млрд КОЕ/мл). На 11-е сут проводили убой и делали посевы биоматериала (мышцы, печень и сердце) на мясопептонный агар и в мясопептонный бульон. Также анализировали инвазивность микроорганизмов рода Bacillus на мышах линии С57Black. Животным вводили орально по 100 мкл культуры микроорганизма 1 раз в сутки в течение 2 сут подряд. На 3-и сут проводили убой и делали посевы материала печени и сердца на Eugonic агар, мясопептонный агар и в мясопептонный бульон. При проведении теста на наличие биосурфактантной активности Oil spreading assay культуральную жидкость разводили дистиллированной водой и вносили 20 мкл нефти. В качестве негативного контроля использовали дистиллированную воду, в качестве позитивного контроля — SDS (sodium dodecyl sulfate, 1 % v/v). Разрушение нефтяного пятна учитывали как положительный результат. Только 27,5 % культур микроорганизмов рода Bacillus инициировали образование антител к собственным корпускулярным антигенам при пероральном введении мышам F1 (A/Sn × Balb/C). Среди изученных культур B. subtilis образование антител вызывали 71,42 %. Образование антител также стимулировали культуры других видов: B. atrophaeus B8, изолят B23 B. zhangzhoulensis (по другим источникам отнесен к B. pumilus или B. safensis),штамм B. licheniformis В10. Большинство микроорганизмов рода Bacillus не стимулировали продукцию антител к собственным антигенам. Культуры B. mucoides/B. weihenstephanensis B31, B. simplex B32, B. thuringiensis B20, B. subtillis, B. amyloliquefaciens 2-15, Bacillus spp.1’-37-7 оказывали патогенное действие, сопровождавшееся гибелью мышей при пероральном введении: погибало от 25 до 50 % особей. При пероральном введении культур рода Bacillus птице у всех опытных кур грудные и бедренные мышцы были контаминированы на 100 %, печень и сердце — соответственно на 96 и 52 %. Инвазивность для мышей характеризовалась выявлением микроорганизмов в образцах печени и сердца через 18 ч после последнего перорального введения. Устойчивой инвазивностью обладали культуры Bacillusspp. B56, Bacillusspp. В50, B. atrophaeus B8 и B. safensis В23. Однако антитела были обнаружены только к B. atropheus B8 и B. safensis В23. Биосурфактантной активностью обладали культуры B23 и В24 B. zhangzhoulensis/B. safensis/B. pumilus, B. atrophaeus B8. Статистически значимой ассоциации между наличием биосурфактантной активности и инвазивностью на анализируемой выборке мы не обнаружили. Таким образом, потенциал пробиотических штаммов на основе микроорганизмов Bacillus subtilis в качестве носителей рекомбинантных вакцинных антигенов представляется нам наиболее перспективным.

KW - Bacillus

KW - feed vaccines

KW - immunofluorescent agglutination test

KW - immunogenicity

KW - invasiveness

KW - recombinant vaccines

KW - spore-forming probiotics

KW - vaccination

KW - vector strain

UR - https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85204446198&origin=inward&txGid=a1d28f146c7338296c61f1641aabec24

UR - https://www.mendeley.com/catalogue/acf81eb7-9417-3ab8-af0e-f4644c058752/

U2 - 10.15389/agrobiology.2024.4.814rus

DO - 10.15389/agrobiology.2024.4.814rus

M3 - статья

VL - 59

SP - 814

EP - 825

JO - Sel'skokhozyaistvennaya Biologiya

JF - Sel'skokhozyaistvennaya Biologiya

SN - 0131-6397

IS - 4

ER -